離心技術(shù)是利用物體高速旋轉(zhuǎn)時產(chǎn)生強大的離心力,使置于旋轉(zhuǎn)體中的懸浮顆粒發(fā)生沉降或漂浮,從而使某些顆粒達到濃縮或與其他顆粒分離之目的。這里的懸浮顆粒往往是指制成懸浮狀態(tài)的細胞、細胞器、病毒和生物大分子等。離心機轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)時,當懸浮顆粒密度大于周圍介質(zhì)密度時,顆粒離開軸心方向移動,發(fā)生沉降;如果顆粒密度低于周圍介質(zhì)的密度時,則顆粒朝向軸心方向移動而發(fā)生漂浮。常用的離心機有多種類型,一般低速離心機的最高轉(zhuǎn)速不超過6000rpm,高速離心機在25000rpm以下,超速離心機的最高速度達30000rpm以上。
根據(jù)離心原理,可設(shè)計多種離心方法,常見下列三大類型:
1.差速離心法。通過逐步增加相對離心力,使一個非均相混合液內(nèi)形狀不同的大小顆粒分步沉淀。
2.密度梯度離心法。離心前,離心管內(nèi)先裝入分離介質(zhì)(如蔗糖、甘油等),使形成連續(xù)的或不連續(xù)的密度梯度介質(zhì),然后加入樣品進行離心,具體又可分為:
(1)速度區(qū)帶離心法。離心前,離心管內(nèi)先裝入蔗糖、甘油、CsCl、Percoll等密度梯度介質(zhì),待分離樣品鋪在梯度液的頂部,離心管底部或梯度層中間,同梯度液一起離心,利用各顆粒在梯度液中沉降速度或漂浮速度的不同,使具有不同沉降速度的顆粒處于不同密度的梯度層內(nèi)醫(yī)學教`育網(wǎng)整理,達到彼此分離的目的。本法可分離各種細胞、病毒、染色體、脂蛋白、DNA和RNA等生物樣品。
(2)預(yù)制梯度等密度離心法。要求在離心前預(yù)先配制管底濃而管頂稀的密度梯度介質(zhì),常用介質(zhì)有蔗糖、CsCl、Cs2SO4等,待分離樣品一般鋪在梯度液頂上,如需挾在梯度液中間或管底部,則需調(diào)節(jié)樣品液密度。離心后,不同密度的樣品顆粒到達與自身密度相等的梯度層,即達到等密度的位置而獲得分離。
(3)自成梯度等密度離心法。某些密度介質(zhì)經(jīng)過離心后會自成梯度,例Percoll,可迅速形成梯度,CsCl、Cs2SO4和三碘甲酰葡萄糖胺經(jīng)長時間離心后也可產(chǎn)生穩(wěn)定的梯度。需要離心分離的樣品可和梯度介質(zhì)先均勻混合,離心開始后,梯度介質(zhì)由于離心力的作用逐漸形成管底濃而管頂稀的密度梯度,與此同時,可以帶動原來混合的樣品顆粒也發(fā)生重新分布,到達與其自身密度相等的梯度層里,即達到等密度的位置而獲得分離。
3.沉降平衡離心法。根據(jù)被分離物質(zhì)的浮力密度差別進行分離,所用的介質(zhì)起始密度約等于被分離物質(zhì)的密度,介質(zhì)在離心過程中形成密度梯度,被分離物質(zhì)沉降或上浮到達與之密度相等的介質(zhì)區(qū)域中停留并形成區(qū)帶。